多肽类药物 一文初识“多肽”药物及其开发

多肽药物(我第一次了解“多肽”药物及其发展)。

小分子越来越难制造，大分子发展强劲，这似乎是深圳生命网近年来在药物研发市场的重要表现之一。许多公司的老板和科研人员已经开始将研发目标瞄准大分子生物药物。但客观来说，小分子化学药物的发展模式与生物大分子药物在很多方面都有明显的不同，科研人员要实现快速“跨界”确实很难。因此，“多肽”药物在深圳小分子和大分子之间的活网可以说是一个很好的过渡转折点。当然，多肽药物绝不是鸡肋。从发现到今天，它们一直是生命科学家、化学家和药理学家关注的焦点。目前已有80多种药物投放市场，部分品种已发展成为年销售额数十亿美元的重磅炸弹。因此，无论是研发方向上的转变，还是技术上的过渡，都是药物研究者了解和深入挖掘多肽药物的必要教训之一。

肽的性质和特点。

多肽广泛存在于生物系统中，是信号分子、传递分子和消化分子。作为信号分子，多肽控制生物体的生物功能，如细胞分裂、交配、趋化性、疼痛、生长和免疫。多肽合成已经成为生物化学、药理学、免疫学和生物物理学中最强大的工具之一。多肽作为一种转运分子，可以促进离子通过细胞膜通道。多肽作为消化分子，在细胞和整个生物的营养吸收中起着重要作用。此外，多肽还可以用作保护剂，例如具有优异抗菌和抗病毒特性的抗生素。目前，多肽是一种重要的商业实体，已被用于不同的治疗领域，如糖尿病、过敏、抗感染、肥胖、诊断、肿瘤、关节炎和心血管疾病。

由于多肽类药物主要来源于内源性多肽或其他天然多肽，通常结构明确，作用机制明确，很多性质往往介于小分子化学药物和大分子蛋白质/抗体药物之间。例如，与小分子化学药物相比，半衰期一般较短，不稳定，容易在体内快速降解，不稳定的制剂需要低温保存，成本较低以及高分子药物(尤其是长链多肽)等。与大分子蛋白质相比，它具有更好的稳定性、更少的用量、更高的单位活性和更低的成本。而且多肽的化学合成技术成熟，容易与杂质或副产物分离，纯度高。

上述缺点，如稳定性问题，一些多肽可以通过修饰或与其他材料形成稳定的复合物进行修饰；成本问题，随着科技的进步，设备的更新和工艺的改进，成本可以得到更好的控制。多肽类药物最大的问题是不能口服，主要是容易降解，难以通过肠黏膜。然而，也有各种替代的给药方式，如皮下注射和鼻腔喷雾。

表1:多肽、传统化学药和蛋白质药的简单比较。

多肽的分类。

根据来源分类，肽可分为生物活性肽和人工合成肽。按大小可分为小肽、中肽和大肽。小肽是指含有少于15个氨基酸残基的多肽，中肽是指含有15至50个氨基酸残基的多肽，含有50个以上氨基酸残基的多肽称为大肽。根据结构分类，多肽可分为同肽和异肽。同肽包括直链肽和环肽，异肽包括色素肽、糖肽、脂肽和缩肽。按功能分类，多肽可分为运动蛋白、激素蛋白、毒性蛋白、多肽激素、酶蛋白、多肽抗生素和毒性肽。

肽研发~代表性事件。

20世纪初，菲舍尔首次合成了具有特定序列的多肽。

1932年，博格曼等人用苄氧羰基保护氨基，多肽合成取得了一些进展。

1953年，Vigneaud成功合成了第一个多肽药物催产素。

1963年，梅里菲尔德以树脂为固相载体，成功合成肽序列，创立多肽固相合成。

20世纪60年代末，梅里菲尔德发明了第一台全自动肽合成仪，并首次合成了生物蛋白酶(124aa)。

20世纪70年代，脑啡肽等阿片肽在大脑中的发现，将神经肽的研究推向高潮。

1972年，卢·卡皮诺首次使用FMOC保护氨基，并迅速得到广泛应用。

1984年，梅里菲尔德因发明肽的固相合成而获得诺贝尔化学奖。

多肽药物的研究与开发。

目前全球批准上市的多肽类药物有80多种，药品数量主要分布在肿瘤、糖尿病、感染、免疫、心血管系统、泌尿系统等。最初，在20世纪70年代之前，平均每年只有不到一种多肽药物进入临床试验。在20世纪70年代，平均每年只有大约一名患者进入临床试验。在20世纪80年代和90年代，平均每年大约有5到10个临床试验进入。21世纪前10年，进入临床试验的多肽药物数量有所增加，平均每年约17种。

多肽药物市场。

透明市场研究的市场报告显示，2015年全球多肽药物市场规模接近200亿美元，2020年将达到237亿美元，2014-2020年复合增长率约为2.8%。多肽主要用于治疗与癌症和代谢紊乱相关的重大疾病，与这些疾病相关的药物具有非常重要的全球市场。目前全球药物市场上多肽类药物总体上有80多种，200-300种多肽类药物在临床试验中，500-600种在临床前试验中，更多的多肽类药物处于实验室研究阶段。可以预见，未来将有越来越多的多肽药物获得FDA批准进入药物市场。一些现有的多肽药物已经有相当大的消费市场。药物品种方面，2016年多肽类药物销量居前的仍然是醋酸格拉替利，销量连续多年超过40亿美元，其次是利拉鲁肽和生长激素，全球销量超过20亿美元，其次是奥曲肽、亮丙瑞林、特立帕肽、艾塞那肽、戈舍瑞林等。

获得多肽的方法(以下主要是技术方面)。

主要有三个来源:自然提取、生物和化学。

1.从天然产物深圳生活网中提取活性成分。

一些天然产物中含有活性成分，可以通过溶剂萃取法从简单混合物中提取出来。如果天然产物成分复杂，活性成分含量很少，需要酶解或微波辅助消化降解蛋白质前体，通过检测设备分离检测活性片段，可以快速有效地从混合物中找到具有活性的小肽。

2.生物合成(基因重组技术)。

基因重组技术是将多肽的基因序列构建到载体上，形成重组DNA表达载体，在原核或真核细胞中表达、提取和纯化多肽分子。该方法适用于制备50个氨基酸以上的目标多肽，且易得。随着基因工程多肽生产技术的提高，基因工程多肽药物的开发和临床应用不断加快。

3.化学合成(包括液相和固相)。

液相法是最早发展起来的多肽合成方法:该工艺是将所需的氨基酸或短肽制备成溶液，其中一个氨基酸的氨基端、另一个氨基酸或短肽的羧基端以及不参与反应的侧链基团都受到化学基团的保护，而参与反应的氨基酸或短肽的羧基则需要在溶液中活化后偶联。反应完成后，通过各种方法分离除去未参与反应的原料和活化剂，得到纯化的多肽产品。肽的液相分段合成主要分为天然化学连接和施陶丁格连接。天然化学连接是肽合成的基本方法。限制是合成的肽必须含有半胱氨酸(Cys)残基，限制了天然化学连接的应用范围。天然化学连接的延伸包括化学区域选择性连接、可移除辅助连接和光敏辅助连接。Staudinger连接法是另一种基本的片段连接方法，为多肽片段连接开辟了更广阔的思路。正交化学连接法是施陶丁格连接法的延伸，通过简化磷硫酯辅助基团来提高片段间的缩合率。

固相肽合成(SPPS，非常重要！)，这是目前广泛使用的多肽合成方法:原理是将多肽序列C端第一个氨基酸的羧基通过酯化反应固定在不溶性载体(树脂+接头)上，然后以此氨基酸为氨基成分，去掉氨基保护基，与过量的活化羧基成分反应形成肽键，再重复脱保护、缩合、洗涤操作，延长肽链长度，从而得到所需长度的肽链。最后，用酸(如三氟乙酸)从树脂上切下肽链，同时除去所有的保护基团。通过高效液相纯化后，获得所需多肽。经过多年的研发，不仅克服了液相合成费时、繁琐的问题，还减少了操作带来的损失。最大的优点是合成中的所有纯化步骤都是通过简单的洗涤和过滤完成的，大大降低了纯化的难度。它具有方便、快捷、操作简单、收率高等优点。其优点是易于实现自动化，使其成为肽化学合成的首选。

图1:多肽合成原理示意图。

图2:固相合成示意图。

图3:固相合成的技术细节。

多肽合成仪

世界上第一台真正意义上的肽合成仪出现于20世纪60年代末至70年代初，利用氮气鼓泡搅拌反应物和计算机程序控制实现有限自动合成，代表来自贝克曼公司的贝克曼990肽合成仪和Vega的296肽合成仪；来自维加生物技术公司。第二代肽合成仪诞生于20世纪80年代，代表蛋白科技公司推出的PS3肽合成仪和ACT肽合成仪90型；由先进化学技术公司推出。第三代肽合成仪诞生于20世纪90年代，其代表产品是来自Applied Biosystems的ABI433肽合成仪和来自CS Bio的无死角CS336肽合成仪。

图4:第三代肽合成仪的代表性产品。

多肽药物的质量控制。

多肽药物的质量控制来源于合成多肽药物，质量研究可以参考一般化学药物的研究思路。质量控制主要包括性状、鉴别和检查，包括一般杂质、有关物质、残留溶剂、晶型、粒度、溶液的澄清度和颜色、干燥和水分损失以及异构体。此外，多肽类药物还有特殊的检验项目，如氨基酸比例、生物活性检验、相关肽、抗衡离子含量、肽图分析、聚合物和抗高血压物质检验等。，以及含量和效价测定。至于合成多肽的理化性质，除一般常规项目外，还应注意等电点、比旋度、缓冲溶解度等。

多肽类药物因易酶解、半衰期短、脂溶性差而被注射给药。主要剂型有冻干粉针剂和注射剂。对于普通注射液和注射用冻干粉，由于多肽类物质的不稳定性和易降解性，质量控制项目侧重于有关物质的检查。合成肽中的相关物质可分为四类，主要如下:

1)加工合成过程中带入的杂质~缺失肽、断裂肽、插入肽、未保护肽等肽相关物质；

2)杂质~肽脱酰胺、氧化、还原、水解、二硫键错配、-消除等不稳定因素产生的降解产物。；

3)聚合物-二聚体和聚合物；

4)光学杂质~外消旋体、非对映体杂质。

多肽类药物制剂主要是注射剂和粉针剂，在生产和储存过程中更容易发生降解，产生降解杂质。多肽类药物的检测方法主要有反相高效液相色谱、毛细管电泳、高效液相色谱-质谱和高效分子排阻色谱。

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